之前小编已为您介绍无菌医疗器械初包装洁净度评价前两种方法：微粒污染物和微生物负载，本期小编为您介绍细菌内毒素检查相关内容。

内毒素（Endotoxin）是一种高分子量的脂多糖成分，分布于革兰氏阴性菌的细胞壁上，如果进入人体的血液或组织中能够导致发热、脑膜炎和血压快速降低等症状。内毒素污染很难预防，因为它普遍存在于自然环境中，稳定而且体积小，能够穿透传统的无菌过滤器。国家药监局规定对于特殊的医疗器械，出厂前必须进行细菌内毒素检查。无菌医疗器械初包装与产品直接接触，其洁净度直接影响到产品洁净度，因此初包装上的细菌内毒素检查对产品安全也至关重要的。本文主要介绍内毒素检测方法及其应用。

细菌内毒素测试发展历程

现在细菌内毒素最常用的检查法一般是鲎试剂试验法。1964 年由美国学者 Levin 和 Bang 发现微量革兰阴性菌内毒素可以引起凝胶反应，从而在1968年创立了一种定性或定量检测微量细菌内毒素的体外分析方法(鲎试剂检测法)。由于其灵敏度高、特异性强而且操作简便、快捷，目前在许多领域得到了突飞猛进的发展，其应用已深入到药学、医学、微生物学以及临床检验等各个领域。1980年，《美国药典》第20版首先收载鲎试剂法作为细菌内毒素检查法，随后欧洲、日本药局等各方也相继收载了这一方法。1995年，《中国药典》1995版二部附录收载了修订后的细菌内毒素检查法。2003年，细菌内毒素定量检测开始在我国临床全面开展应用。

医疗器械细菌内毒素检测标准：

• GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具 检验方法 第 2 部分：生物学试验方法；
• 2015 年版《中国药典》1143 细菌内毒素检查法

检测用试剂

• 细菌内毒素国家标准品、细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水。

检测设备

• 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、漩涡混合器。

试验前准备

• 器具处理

试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。玻璃器皿置电热干燥箱内180℃于烤至少2 h，或250℃干烤至少30 min。塑料器皿置30%双氧水中浸泡4 h;再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后置60℃烘干备用。

• 鲎试剂灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行省试剂灵敏度复核试验。

• 供试品干扰试验

对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何可能影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰试验。

试验方法

• 供试品数量

同一批号至少3个单位供试品

• 浸提介质

细菌内毒素检查用水。

• 供试品液制备

根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积，选择下列适用方法制备供试液;

a） 管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中浸提不少于1 h;

b) 小型配件或实体类器具置无热原玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次，在（37±1）℃恒温箱中浸泡不少于1 h。

注：供试液贮存应不超过2 h。

• 检查方法

• 鲎试验法则是目前最常用的内毒素检测方法。我国药典收载的细菌内毒素检测方法为鲎试验法，鲎试验法有定性和定量之分，其按试验方法还可进一步分为凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。当各种检测法得到的检测结果不一致时，以凝胶法的检测结果为准。
• 凝胶法系应用鲎试剂可与内毒素发生凝集反应的原理来定性或半定量检测内毒素的一种鲎试验法，检测时鲎试剂须以除热原水（内毒素检查用水）复溶后使用，通过观察有无凝胶形成作为检测终点。凝胶法检测操作简便、经济，不需使用专用检测设备。本试验操作过程应防止内毒素的污染。
• 动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法都是内毒素的定量检测方法。动态浊度法和终点浊度法都属浊度法。浊度法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来检测内毒素含量的鲎试验法。动态显色法和终点显色法都属显色基质法。显色基质法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物游离出生色团的多少来检测内毒素含量的鲎试验法，根据产物色度计算内毒素水平，又被称为比色法。
• 定性鲎试验法主要用于药品、医疗器械等样本的内毒素监测。定量鲎试验法主要用于临床患者的内毒素检测，为其临床诊治提供参考。

试验报告

试验报告中宜给出下列信息：

1. 供试品名称;
2. 生产批号;
3. 供试液制备方法;
4. 细菌内毒素限量;
5. 结果判定。

内毒素检测在其他领域中的应用

内毒素检查法现除可用于初包装检查，还被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械以及动物和人体体液等不同样本中的内毒素。

• 药品中的应用

内毒素检查法还用于各种药品的质量控制，在医药工业的GMP条件下，“热原就是内毒素，控制内毒素就是控制热原”已成为共识，用细菌内毒检查法代替热原法也符合动物福利的3Ｒ原则，因此细菌内毒素检查法在今后的应用会越来越多。

• 输液器及外科手术器材

内毒素检查法已广泛用于临床一次性使用输液输血器具、无菌注射器、无菌注射针及外科手术器材等的检查。

• 临床中辅助诊断

细菌内毒素检查法的敏感性和特异性都很高，对诊断革兰阴性菌所致败血症、内毒素血症、泌尿系统及中枢神经系统感染均有一定意义，有助于早期判断感染类型，有利于指导临床用药及判断预后。

总结：

内毒素检测主要通过鲎试验法来进行，分为凝胶法和光度测定法，后者又分为浊度法和显色基质法。细菌内毒素检测不仅可以用于无菌医疗器械初包装洁净度评价，也广泛应用于药品、医疗器械等样本的内毒素监测，同时还可用于临床患者的内毒素监测，为其临床诊治提供参考。

【参考资料】GB/T 14233.2-2005；细菌内毒素检测方法及其临床应用[J].上海医药,2018,39(21):3-6.

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